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ウィルス学

赤血球凝集反応および赤血球凝集阻止試験（１）赤血球凝集(hemagglutination :HA)反応について　ウイルスの粒子が赤血球を凝集させる現象は、1941年、インフルエンザウイルスで初めて報告された。インフルエンザウイルスの場合におけるシアル酸など、赤血球上の特定の分子に結合、赤血球凝集を起こすウイルス遺伝子産物は、血球凝集素(hemagglutinin:HAnin)と呼ばれる。インフルエンザウイルス、麻疹ウイルスなどでは、エンベロープ糖タンパクの一つがHAnin活性を担っている。　インフルエンザウイルスの場合、HA活性を残したまま感染性を失わせることが可能で、実習では感染の危険なくHA、HIを行える。ウイルス抗原の原液を薄めていくと、HAninの活性も次第に弱まる。明確なHA像を与える抗原の最終希釈倍数をHA価(hemagglutination unit:赤血球凝集素抗原価)という。今回の実験の場合、Ａ型では６４ＨＡ価／５０μl、Ｂ型では３２ＨＡ価／５０μlとの値が得られた。

（２）赤血球凝集阻止(hemagglutination inhibition :HI)試験について　ＨＡタンパク(HAnin)は、Ａ型やＢ型のウイルスの病原性に深く関わっているだけでなく、感染後に成立する免疫は主にこのタンパクに対する中和抗体によってもたらされる。そして、HAninを抗原として認識する抗体が、HAninと結合すると、HAが抑制されることを利用して、HAninに対する抗体(HI抗体)の有無の判定あるいは抗体価を判定することをHI試験という。 ※ 一般に血清中にはHI抗体以外にもHAあるいはHIに影響を与える物質が含まれている。HI試験を正しく行う（HAninに対する特異的抗体を検出・抗体価を定量する）ためには、被検血清に前処理を行ってこれらの物質を除去しなければならない。検査するウイルス、用いる動物血球の種類によって具体的な処理は異なるが、以下に示す２つを行うのが原則である。・ HI抗体以外の赤血球凝集抑制(HI)活性の除去（今回の実習では耐熱性のα-inhibitorを除去するためにＲＤＥで処理し、易熱性のβ-inhibitorを除去するために56℃で30分反応させる。）・血清中に含まれる赤血球凝集(HA)活性の除去（今回の実習では血清をニワトリ赤血球と混和し、静置した後遠心して赤血球を除く。）　今回の実習では、前頁に示した通り、与えられた血清はＡ型、Ｂ型両方のインフルエンザウイルスに対する抗体を持ち、Ａ型のＨＩ抗体価は１：３２０、B型のＨＩ抗体価は１：１６０であるという結果が得られた。

（３）ペア血清(paired serum)について（講義の復習）　ウイルスに感染すると、患者の血清中には抗体が上昇するが、発病時より、回復時に増加が起こることが多い。従って、特定のウイルス感染が疑われる患者の感染期（急性期）の血清と、その後数週間たった時期（回復期）の血清を採取し（ペア血清）、その特定のウイルス抗原と反応させ、回復期の血清中の抗体が感染期の抗体と比べて有意に（４倍以上）上昇していれば、そのウイルスに感染していたと診断できる。　急性期と回復期の２種類の血清を採取するのは、正常な（ウイルスに感染していない）ヒトの血清中にも、ヘルペスウイルスなど、様々なウイルスに対する抗体が見られるので、感染によって増加したかどうかを判断するのに比較対照が必要なためである。このペア血清を用いた診断は、血清を採取した患者に対する治療の役には立たないが、疾患の確定診断を下す場合や、疫学的な研究には重要である。

４．設問（１）インフルエンザウイルス赤血球凝集素のa)ウイルス感染細胞での合成過程、b)ウイルス粒子における赤血球凝集素の役割　について説明しなさい。 a) 　Ａ、Ｂ型インフルエンザウイルスは８つに分節した一本鎖マイナスＲＮＡゲノムを持つ、オルトミクソウイルス科の直径80～120nmの球状粒子である。このウイルスは、第７、８セグメントがそれぞれスプライシングによって２種類ずつのタンパクを作ることから、計１０種類のタンパクを作るが、そのうちの３つ（PB1、PB2、PA）はゲノムからｍRNAを合成するためのRNAポリメラーゼである。インフルエンザウイルスは、他の多くのＲＮＡウイルスとは異なり、感染細胞の核へ移行してからｍＲＮＡを合成する。これは、ｍＲＮＡ合成時に宿主細胞のｍＲＮＡに由来するキャップ構造と、それに続く一部塩基配列(leader sequence)が、プライマーとして活用されるためである。ＲＮＡポリメラーゼのうち、PB2がこのキャップ構造の認識と切断を行い、PB1が転写開始、PAが転写伸長に働く。感染初期には、RNAポリメラーゼ（前述の３種）、NP、NSの合成が先行し、ゲノムRNAの複製とヌクレオカプシド形成が進む。感染後期になってHA、M、NAの合成促進と細胞膜への輸送により、エンベロープ構造ができると、８種類のヌクレオカプシド１組がエンベロープをかぶりながら出芽する。出芽直後のウイルス粒子はNAが周辺のシアル酸基を切断することにより、効率よく細胞表層から遊離していく。 ※　このNAの働きを阻害すれば、合成されたウイルス粒子はいつまでも感染細胞表層から遊離できず、増殖できない。このことを利用した抗インフルエンザウイルス薬がザナミビル、オセルタミビルであり、オセルタミビルの商品名がタミフルである。

b) 　インフルエンザウイルスが細胞に感染するには、ＨＡタンパク質が宿主細胞由来のトリプシン様のタンパク質分解酵素によってＨＡ１とＨＡ２に開裂することが必要である。まず、ＨＡ１で細胞表面にあるシアル酸レセプターに吸着すると、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれ、エンドソーム内で、酸性条件下において立体構造を変え、ＨＡ２がウイルスエンベロープ脂質二重膜と、エンドソーム脂質二重膜との融合が起こり、ヌクレオカプシドが細胞内に放出される。（酸性条件下で立体構造が変わるためには、開裂が起こっていることが必要で、ＨＡの開裂が起こっていない場合には膜融合が起こらず、感染はここで止まる。）　　　続いて、ヌクレオカプシドに付着しているＲＮＡポリメラーゼ（前述）がウイルスゲノムＲＮＡを転写して、プラス鎖ｍＲＮＡを合成する。

（２）ウイルスに対する抗体の検出法には、HI以外にどのような方法があるか。

酵素免疫測定法(EIA)enzyme immunoassay 既知抗原を固相化して、これに被検血清を反応させ、捕捉された特異抗体を検出する。

蛍光抗体法fluorescent antibody technique ウイルス抗原が存在する細胞に抗体を反応させ、その抗体に対する二次抗体に蛍光色素をラベルしたものを反応させることにより、ウイルス抗原に対する抗体価を測定する。

免疫ブロット法immunoblotting 界面活性剤で壊したウイルス粒子の構成ペプチドを電気泳動などで分画し、酸素免疫測定法と同様の原理で、分画されたペプチドと結合した特異抗体の存在を発色あるいは蛍光シグナルで検出する。

受身凝集法passive agglutination ウイルス抗原を赤血球などに固着させ、抗体と反応させると架橋されて、これら担体の凝集像が肉眼的に観察できる。

補体結合反応complement fixation test 一定量の補体をめぐる２つの異なる抗原抗体反応の競合反応。（１つがヒツジの赤血球と溶血素との、もう１つがウイルス抗原とその特異抗体との）ウイルスの生物活性に依存せず、抗原を変えるだけで各種の病原体に対する抗体測定が可。

中和試験neutralization test 異なる希釈度の患者血清と一定量のウイルスを混和し、ウイルスに感受性を持つ培養系にその混和液を接種する。十分な培養期間を経過してから、感染病変の有無を判定する。検査室での取り扱いが便利である。沈降反応可溶性の抗原が抗体と結合してできた格子状の結合物をゲル内で沈降させて観察する方法。抗原性の異同や交差性を肉眼的、簡単に観察できる。

ファージの増殖と定量３）１００分経ったときの菌１個あたりのファージ量は？　GT1から求める。（GT2は数え切れないほどのプラークができたため）　１００分後、原液のファージ量は、上の表より、1.1×10^11/mlである。はじめの菌数（ファージ遺伝子の数に等しい）は２×10^8/mlであるから、ファージ遺伝子ははじめ２×10^8/mlあったことになる。よって、１つのファージ遺伝子から、 1.1×10^11÷（２×10^8）＝550個の子孫ファージができる。

（４）初めてファージ粒子が出現するのはいつか。上記の表より、約５分以降20分以内である。

３．考察　バクテリオファージには、細菌に感染すると菌内で増殖し、溶菌を起こすものと、細菌の染色体にファージのゲノムが組み込まれ、細菌の分裂と共に細菌の染色体の一部として子孫の細菌に伝えられるものがある。（溶原化）　溶原化を起こす代表的なファージには、大腸菌に感染するバクテリオファージλが挙げられる。野生型のλを大腸菌に感染させると多くは大腸菌の中で増殖して溶菌を起こすが、一部は溶原化を起こす。

　プラークとは、ファージの感染により細菌が溶菌し、プレート上で透明に抜けて見えるところを言う。１個の細菌ではプラークとして観察されないが、最初に感染した菌から放出されたファージは周りの細菌に感染し、それを繰り返すことにより肉眼でも認められるような抜けを形成する。このひとつひとつをプラークと呼ぶ。すなわち、１つのプラークは１つのファージに由来する。プラークの数を数えることにより、感染性を持つファージの量を決めることができる。

　今回の実習では、原液を２×10^6倍に希釈したGT2と、２×10^8倍に希釈したGT1を用いた。これは、濃度の異なる２つのサンプルを用いることで、より正確なデータを得るためであると考えられる。つまり、経過時間が短いうちは、(20-1の９個のように)GT1は数が少なく誤差が大きい。これに対しGT2は経過時間が長くなると、プラークの数が増えすぎ、数えられなくなる。これを２つのサンプルで補うのだと思われる。

　グラフを見ると、初めにファージ粒子が出現してから６０分ほどまでは、ファージが直線的に（つまり指数関数的に）増加していくのがわかる。それ以降も増加はしているものの、その速度がずっと緩やかになっている。これはファージの数が増えることにより、環境が悪化（栄養の不足、溶原菌の不足など）することによるのではないかと考えられる。また、６０分後のデータが８０分後のデータを上回っているのは、１００分後のデータから見ても不自然である。これは、サンプルを採取する際の混和が不十分であった、などの操作ミスによるものと考えられる。

４．設問（１）熱処理後初めてファージ粒子が出現するまでの間（暗黒期、eclipse period）に、細胞内では何が起こっているか。　　ファージ粒子の合成が進行している。　　ファージの頭部、尾部、尾線維はあるところまでは別個の系列としてつくられ、最後にそれがまとまって感染性を持つ粒子、すなわちビリオンになる。まとまって粒子が形成される段階を成熟期というが、この時期までは菌体内に感染性を持つファージは全く認められない。（暗黒期）

（２）この実験は、プロファージとして細菌に感染しているλファージを熱処理で誘発して、その細胞内増殖を見ている。一般には、細胞ないしは細菌に外からウイルスを感染させて、ウイルスの増殖を調べたものを一段増殖曲線という。これについてのべよ。　一段階増殖実験…ウイルスの増殖機構を解析する方法の一つ。ウイルスを培養細胞へ、５～40感染性ウイルス／１細胞の割合で感染させ、（すべての細胞が感染するために、感染の多重度を高くする。）未吸着ウイルスを洗浄、その後の経時的ウイルス産生量を測定する。　一般に、細胞に感染したウイルスは細胞内で脱殻を受け、ウイルス粒子は消失した状態となり、感染性ウイルスが証明されるまでの間の期間を暗黒期という。一方、感染後細胞外にウイルス粒子が証明されるまでの期間を潜伏期と呼ぶ。また、急速なウイルス増殖が起こる時期を増殖期という。　ウイルスの一段増殖に要する時間はウイルスによって異なるが、およそ0.5～１日と言える。　バクテリオファージの増殖の解析に開発された方法であるが、動物ウイルスの系においても、同じような解析が可能である。

（３） LE392のgonotypeは、supF58,λ-である。指示菌として、LE392が適している理由を考察せよ。　まず、λファージの増殖を見るのであるから、最初にλファージの遺伝子を持っていてはならない。（λ－でないとならない。）また、実験に用いたλファージはＳ遺伝子のナンセンス変異（Sam7）のため、溶菌を引き起こせない。指示菌については、プラーク形成のため、溶菌を引き起こさねばならない。そこで、SupF変異を持つ大腸菌を用いて、S遺伝子のAmber mutationにTyrを運んでくることにより、S遺伝子タンパクと類似のタンパクを合成させ、溶菌を引き起こすことができる。　以上から、指示菌にはLE392(SupF58,λ-)が適していると言える。

（４） Tyr-tRNAのanticodonが変異してstop codon(UAG)に対応するようになったのなら、本来のTyrのcodonの方は、対応するtRNAがなくなって困るように思われるが、そうならないのはなぜか。　TryのtRNAをコードしている遺伝子には３種類がある。そのうちの１つが主要な分子種をコードし、ほかの２つはこれよりもはるかに少量しか存在しないTryのtRNAをコードしている重複遺伝子なのである。　この２つの重複遺伝子は、大腸菌染色体上でたった200bpしか離れておらず、今回のようなサプレッサー変異が起こる部位は常にこの２カ所である。　つまり、３つあるtRNAのうちのより少ない２つのTyr-tRNAのanticodonが変異してstop codon(UAG)に対応するようになったものの、主要な１つは変異していないため、問題は生じないのである。

参考文献

ウイルスによるcytopathic effect(CPE)とplaqueの観考察　培養細胞にウイルスを感染させたときに細胞に認められる変化をCPEとよぶ。ウイルスを感染させて１～数日後の細胞を倒立顕微鏡で観察した。　ファージの場合と同じように、（細菌ではなく培養細胞を用いれば）動物ウイルスもplaque titrationによりウイルスの感染価を定量することができる。ウイルスにより、形成されるplaqueの形や大きさが異なる。

課題（１）ウイルス原液を倍に希釈した液を培養細胞に100μl加えて実験したところ、倍に希釈した液ではフラスコに66個のplaqueが認められた。このデータから、このウイルス原液の感染価を計算せよ。　倍希釈で　66pfu/100μl＝660pfu/ml 　原液では、　　660× pfu/ml＝6.6× pfu/ml　である。（pfu=plaque forming unit）

（２）上の実験に用いたウイルス液を電子顕微鏡で観察し、顕微鏡下に認められたウイルス粒子の数を体積あたりで計算すると、plaque titrationで得られた値に比べて20倍であった。これは何を意味するのか。　plaqueを作るのは、感染性を持つウイルスのみである。つまりこの差はウイルスの総数と、実際に感染性を持ち、指示菌に感染したウイルスの数との差であると考えられる。

型およびD型肝炎ウイルスの細胞レベルでの生活環肝臓を主たる標的臓器として感染を起こす一連のウイルスを肝炎ウイルスと総称し、これらのウイルスにより起こる肝炎をウイルス性肝炎（viral hepatitis）という。従って、全身感染の部分症状として肝炎を起こすウイルス（黄熱ウイルス、EBウイルス、サイトメガロウイルスなど20数種）は除外する。（ただし、臨床的には鑑別診断上重要である。）この「肝炎ウイルス（hepatitis viruses）」という名称は便宜上の命名であり、ビリオンの物理化学的性状のみに基づいたウイルス学的分類とは全く異なる、臨床的な分類である。今日、肝炎ウイルスにはＡ～ＧおよびTT virusの８種類のウイルスが記載されている。　しかし、Ｇ型肝炎ウイルス、TTウイルスにおいては、多数の無症状ウイルス保有者の存在が明らかとなり、肝炎ウイルスとしての病原性が確立したとは言い難いところもある。また、Ｆ型肝炎ウイルスは、その存在が追試確認されておらず、研究が止まっている。つまり、これらの肝炎ウイルスはまだ候補段階で、基本はＡ～Ｅ型肝炎ウイルスであると言える。　以下にＡ～Ｅ型肝炎ウイルスの特徴を表として示す。

２．Ｂ型肝炎ウイルス　このウイルスによる肝炎はかつて血清肝炎と呼ばれ、主に輸血時の血液を介して感染する。性行為でも感染することが知られ、急性患者のうち完治するのは85％前後で、残りは慢性肝炎となる。劇症化する場合も多い。また、治癒しても長くウイルスのキャリアとなることがある。1972年以降、輸血用血液のＨＢＶ検査がなされるようになった結果、輸血による伝播数は激減した。母子感染による垂直感染は、母子感染防止対策事業により、抗ＨＢＶヒト免疫グロブリンの投与とＨＢワクチンの接種が1986年以降の新生児に行われるようになり、新しいキャリアも減少した。

（１）性状　ビリオンは直径42nmの球状粒子、表層の脂質を含むエンベロープと内部のヌクレオカプシドより成る。ヌクレオカプシドには不完全な２本鎖で環状のDNA、DNAポリメラーゼ、プロテインキナーゼが含まれる。　エンベロープとコアは抗原性が異なり、hepatitis B surface antigen(HBsAg?、タンパク質70％、糖質7％、脂質23％よりなる抗原で、この抗原に対する抗体が唯一の中和抗体である。)、hepatitis B core antigen (HBcAg?、核タンパク)と呼ばれる。さらに、HBcAg?を界面活性剤で処理すると、HBeAg?が出現する。（図１参照）HBsAg?は大量に産生されてＨＢＶの表面を覆い、過剰な分は血中に球状または桿状の粒子として存在する。（少なくともHBV粒子本体の1000倍以上）　ＨＢＶのゲノムは不完全な二本鎖の環状ＤＮＡであり、3,182塩基対の長さを持つ長鎖（マイナス鎖）と、その50～85パーセントの長さの短鎖（プラス鎖）よりなる。従って、全体の15～50パーセントは一本鎖である。　このゲノムは、人に感染する二本鎖ＤＮＡウイルスとしては最小であるが、効率よくタンパクをコードしている。すなわち、同一の塩基対を、読み取り枠をずらすことによって別のコドンとして読み取り、別のタンパクを作ることができるのである。遺伝子としてはsurface (pre-S1, pre-S2, S領域よりなり、HBsAg?の構成ポリペプチドをコードしている)、polymerase（DNAポリメラーゼ／逆転写酵素、RNase Hその他をコード）、Ｘ（他の遺伝子をトランスに活性化するタンパクをコード）、およびpre-core/core（両者からHBe、後者のみからHBc抗原が作られる）の４つが知られている。（図２参照）なお、pre-S抗原はHBVが肝細胞内に侵入する際に中心的役割を果たすポリアルブミン（p-HSA）レセプターを有している。このため、pre-S抗体はHBV感染をブロックする有効な防御抗体と考えられている。　HBsAg?にはいくつかの抗原決定基が存在し、その組み合わせによりいくつかの亜型（subype）に分類される。具体的には、共通抗原決定基a、subtype特異抗原決定基dとy、wとrがあり、adr、adw、ayr、aywの４組に分類される。同一感染源からの感染ではsubtypeが一致するため、感染源、感染様式などの疫学的な検索、あるいは民族学的な調査に役立つ。

（２）感染・増殖（生活環）　ＨＢＶは培養細胞での増殖が見られないので、その増殖様式は完全に明らかになったとは言えない。　ＨＢＶの増殖過程は、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写の過程を含むユニークなものである。肝細胞表面のレセプターに吸着、侵入、脱殻（これらの詳細についてはまだほとんどわかっていない）後、ＨＢＶ－ＤＮＡは核内で自分自身のＤＮＡポリメラーゼの作用により完全な二本鎖ＤＮＡとなり、スーパーコイルＤＮＡになって核へ移動する。ついでマイナス鎖ＤＮＡを鋳型として宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼⅡの働きによりHBs抗原を作る短いmRNA（粗面小胞体上で翻訳される）と、HBc抗原およびポリメラーゼを作るゲノムよりもやや長いmRNA（pregenome、翻訳効率は低い）が合成される。ポリメラーゼは合成されると、合成元のmRNAの3'末端に結合する。（HBcタンパクが合成されると、同時にここからマイナス鎖DNA合成が開始される。）　新しく作られたコア粒子の中で、プレゲノムからウイルスポリメラーゼの逆転写活性によりマイナス鎖ＤＮＡが合成され、同じくポリメラーゼのRNase H活性によりＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡが消化され、最後にＤＮＡポリメラーゼ活性により、プラス鎖ＤＮＡが合成される。このプラス鎖の完成を待たずに、コア粒子は小胞体膜から出芽し、この過程でHBs抗原を含むエンベロープを獲得する。ただし、感染初期の細胞では、合成されたＤＮＡが再び核内へと移動し、以上の過程を繰り返すことがある。ウイルスタンパクが十分に蓄積した後に、成熟ウイルス粒子が合成され、エクソサイトーシスによるウイルス粒子の放出が起こるのである。（図３、４参照）　ＨＢＶのレセプター結合部位は、HBs抗原のpre S1であることは、肝細胞を用いたＨＢＶの感染実験を抗pre S1抗体が阻止すること、pre S1ペプチドで免疫したチンパンジーを用いたＨＢＶ感染阻止から確認されてきた。しかし、一方のレセプターについては、未だに特定されていない。むしろ多数のタンパクをレセプターとしている可能性がある。レセプターの候補には、human asialoglycoprotein receptor(ASGPR), glycosaminoglycans(GAG), opsonin receptor, cell-surface-associated IL-6などがあげられている。

３．Ｄ型肝炎ウイルス　Ｂ型肝炎ウイルス感染者の肝細胞中に認められるδ抗原が、それ自体で肝炎を引き起こす感染性因子であることが判明し、Ｄ型肝炎ウイルスと呼ばれるようになった。Ｂ型肝炎ウイルスと共存するため、デルタ肝炎ウイルスまたはヘパドナ付着ウイルスとも呼ばれる。単独では増殖できず、ヘルパーウイルスとしてＨＢＶを必要とする。エンベロープがＨＢＶ由来のHBsから成るためである。ＨＤＶには直接的な肝細胞傷害作用があるとされ、Ｂ型肝炎にこのウイルスの感染が重なると、重篤になることが知られている。

（１）性状　ＨＤＶは直径36nmの球状粒子で、内部に全長1.7kbの一本鎖ＲＮＡをもっており、分子内で塩基対を形成し、二本鎖の桿状構造をとっている。（図５参照）Ｃ＋Ｄ含量が60％と高いのも特徴である。ＨＤＶ粒子の表面はHBs抗原から成り、ゲノムがコードするδ抗原（HDAg、複製に必要）は粒子の内部に存在する。ＨＤＶがHBs抗原で覆われているのは、ＨＤＶそれ自身には増殖能がなく、ＨＢＶ共存下でのみ増殖しうるからであり、この意味でＨＢＶはＨＤＶのヘルパーウイルスとなっている。

（２）生活環　接着、侵入、脱殻の機序についてはよくわかっていない。しかし、エンベロープがＨＢＶと共通であるため、ＨＢＶと同様の様式をとるのではないかとされている。（これらの機序はＨＢＶでも分かっていないことが多いが。）ただし、ＨＢＶは感染できないウッドチャックにＨＤＶは感染できるなど、ＨＢＶとの相違も報告されている。いったん侵入すれば、ＨＤＶはＨＢＶのない環境でも複製を行うことができる。　ＨＤＶ－ＲＮＡはまず（おそらくHDAgによって）核内に移動する。ＨＤＶ－ＲＮＡの転写・複製は感染細胞内の核内にて、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼⅡによって行われる。（ＲＮＡポリメラーゼⅡの働きを阻害するα-amanitinにより阻害されることから。）　RNAの合成は、double-rolling-circle mechanismと呼ばれる仕組みによって行われる。（図６参照）この仕組みにおいてはまず、鋳型のgonome RNA よりも長いantigenome RNAが合成される。合成された長いantigenome RNAは、自己触媒によってgenome１つ分の長さに切断され、同じく自己触媒によって環状に結合する。続いて、今度は新しくできたantigenome RNA環を鋳型としてgenome RNAが同様に作成される。これも自己切断と自己結合により、環状のgenome RNAとなるのである。本来、合成はgenome１つ分の長さで十分であるが、HDVを感染させたチンパンジーやウッドチャックの肝細胞から、genomeの２～３倍の長さをもつ複製中間体ＲＮＡ（antigenome RNAおよびgenome RNA）が見つかったことから、このように考えられるようになった。　もうひとつ、非常に少量ながら（１細胞中に60個ほど。antigenome RNAは6,000個、genome RNAは30,000個あるとされる）0.8kbのアンチゲノム（プラス鎖）RNAが認められる。これはポリＡ配列を持ち、HDAgをコードするmRNAであると考えられている。HDAgは翻訳されると、核内にもどる。HDAgは複製に必要（anti-terminatorとして働く？）であるとされている。ＨＤＶ－ＲＮＡの複製中、特定の部位（S-HDAgの終始コドン）で変位（U→C）が起こる。（RNA editing）すると、S-HDAgの終始コドンがトリプトファンのコドンとなり、24kDのS(short)-HDAgではなく、27kDのL(large)-HDAgが産生されるようになる。L-HDAgは、S-HDAgとは逆に、ＨＤＶ－ＲＮＡの複製を抑制するとされており、HDV genomeがウイルス粒子を形成する際にも必要とされる。なお、このRNA editingはantigenome RNAよりもgenome RNAで起こりやすいという。いずれのHDAgも、合成後にリン酸化を受け、新たにできるウイルス粒子の中におよそ同じ割合で入る。RNA-HDAg複合体はHBsAg?との相互作用によりウイルス粒子を形成するが、詳細な機序は不明である。　ここで、なぜＲＮＡポリメラーゼⅡがＲＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成できるか、について述べる。これには、HDAgがＲＮＡポリメラーゼⅡと複合体を形成し、その特異性を変える、という説が提唱されているが、HDAgを除いた環境でもＲＮＡが合成された、との報告もあり、はっきりしない。ＨＤＶ－ＲＮＡが二本鎖の桿状構造をとっているため、ＲＮＡポリメラーゼⅡがＤＮＡと区別できないため、とも言われている。

（３） HDAg（δ抗原）　HDAgについてまとめておく。　smallとlargeの２つがあり、はじめはS-HDAgが合成されるが、RNA editingによってL-HDAgが産生されるようになる。L-HDAgはS-HDAgよりも19アミノ酸長い。それ以外の構造は基本的に同じであり、δ抗原間の結合を促進するらせん構造、核内局在信号、ＲＮＡ結合領域などを持っている。　働きははっきりしないものも多いが、以下のようなものがある。・ＨＤＶ－ＲＮＡを核内に移動させる。・ＨＤＶ－ＲＮＡが宿主細胞によって分解されるのをこれに結合して防ぐ。・ＨＤＶ－ＲＮＡに結合してポリアデニル化を抑制、antigenome RNAの伸長を促進する。（S-HDAg）・ゲノムの複製を阻害し、粒子形成を促進する。（L-HDAg）

（４）感染・疫学　感染はＨＢＶキャリアに重感染するか、ＨＢＶと同時に感染するかの２通りである。ＨＤＶの重感染では、ＨＢＶキャリアの30パーセントに肝炎の慢性化が見られる。また、同時感染の場合も肝炎は重症化する。（劇症肝炎）ＨＤＶの感染は、ＨＢＶと同様に血液、体液を介する。従って宿主は現在ヒトだけである。　ＨＤＶ感染者は、欧米、中近東、南米、オーストラリアに多く、日本では１％程度である。　遺伝子型は３つが知られ、１型は欧米、中国に、２型は日本に、３型は南アメリカに多い。　予防には、ヘルパーウイルスであるＨＢＶのワクチンが有効である。

補記　Ｂ型肝炎ウイルスについては関連事項が多いので、以下に調べた内容を記す。（１）病原性　ＨＢＶはヒトが唯一の宿主で、チンパンジーなどごく限られた霊長類には実験的に感染させうる。　通常の成人へのＨＢＶ感染は一過性であり、不顕性のことが多い。顕性の場合でも、ＨＢＶは本来宿主細胞に障害を起こさず、肝細胞障害は感染細胞表面に出たウイルス特異ペプチド（主としてHBc抗原に由来）に対する細胞傷害性Ｔ細胞（CD8陽性のものが主）を中心とする免疫学的機序によるものであると理解されている。細胞性免疫の発現そのものが臨床的に急性肝炎としてとらえられるものであり、免疫応答が十分であればＨＢＶは完全に排除される。一方、細胞性免疫が不十分であれば、ＨＢＶは完全に排除されず、持続感染になり、一部が慢性肝炎、肝硬変へと移行する。キャリアは免疫の未熟な新生児、乳幼児期あるいは免疫不全状況下での感染で成立すると考えられている。これは、免疫能が弱いためにＨＢＶに対する免疫寛容状態になるためであると考えられる。幼児のキャリアでは、成人に達する前後から免疫寛容状態が解消されるためか、ＨＢＶに対する細胞性免疫による肝細胞障害が起こり、しばしば急性Ｂ型肝炎との鑑別を要する急性発症と呼ばれる状態を呈する。一方、このような急性発症を経過せずに慢性肝炎の状態になる場合もある。

（２）感染の疫学　ＨＢＶの主要感染経路は、輸血、性行為を介する感染および母子感染である。輸血用血液は厳しくスクリーニングされるため、これによる感染は激減している。また、抗HBsグロブリンの投与と、HBVワクチンの併用により、HBe抗原陽性の母親から子へのHBV感染も有効に阻止されてきている。　ＨＢＶは世界中に広く分布するが、キャリアの頻度は地域によって異なり、人口の0.1～20パーセントに及ぶ。アジア、アフリカに多く、北欧、北米で少ないといい、総数は３億人とされている。キャリアの分布とヒトの肝細胞癌発生率の分布はきわめてよく一致する。このことから、ＨＢＶと肝癌との関係が疑われている。近年、ＨＢＶが発癌ウイルスと共通した領域を持つこと、Ｘタンパクが細胞の遺伝子を活性化したり、p53の活性を抑制したりする可能性などが判明し、その疑いは強まっている。

（３）予防・診断・治療　血液、体液感染するウイルスであるから、採血などに使用される器具、針、チューブなどの使い捨て、器具、衣類の消毒が重要である。また、ワクチンによる能動免疫とHBs抗体価の高い免疫グロブリン（HB免疫グロブリン、HBIG、有効期限は３ヶ月）による受動免疫が用いられる。ワクチンにはＨＢＶキャリアの血漿から、HBs抗原小型球状粒子を精製して作られた第一世代が用いられたが、材料供給が困難なこと、他のウイルスが混入している可能性があることなどから使用されなくなった。これにかわり、現在では、遺伝子工学による組み替え型ワクチンが用いられている。これは、ＨＢＶのＳ遺伝子を酵素に組み込み産生させた小型球状粒子を精製したものである。診断にはＨＢＶ粒子の持つ抗原抗体系を免疫学的に測定する方法と、ＨＢＶの生物学的活性を直接検出する方法がある。抗原抗体系とはHBsAg?とanti-HBs、HBcAg?（これのみは血中に出現しない）とanti-HBc、HBeAg?とanti-HBeのことで、これらをゲル内沈降反応、凝集反応、補体結合反応、酵素抗体法、ラジオイムノアッセイ法などを用いて検出することで、ＨＢＶに現在感染しているか、持続感染か、急性の反応か、などが判断できる。治療には、逆転写酵素阻害剤およびインターフェロン（IFN-β）が用いられる。